GB4789.13-2012 食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验

                                                  中华人民共和国国家标准
                                                      GB 4789.13—2012
                                                       食品安全国家标准
                                        食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验
中华人民共和国卫生部发布
2012-05-17 发布2012-07-17 实施
GB 4789.13—2012
I
前言
本标准代替GB/T 4789.13—2003《食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验》。
本标准与GB/T 4789.13—2003 相比，主要变化如下：
——修改了标准的中文名称；
——修改了样品制备过程；
——修改了培养基与试剂；
——修改了操作步骤；
——修改了菌数计算部分；
——增加了附录A。
GB 4789.13—2012
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食品安全国家标准
食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验
1 范围
本标准规定了食品中产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的检验方法。
本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a） 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃；
b） 冰箱：2 ℃～5℃；
c） 恒温水浴箱：50℃±1 ℃，46℃±0.5℃；
d） 天平：感量0.1 g；
e） 均质器；
f） 显微镜：10×～100×；
g） 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头；
h） 无菌试管：18mm×180mm；
i） 无菌培养皿：直径90 mm；
j） pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸；
k） 厌氧培养装置。
3 培养基和试剂
3.1 胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂：见附录A 中A.1。
3.2 液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：见附录A 中A.2。
3.3 缓冲动力-硝酸盐培养基：见附录A 中A.3。
3.4 乳糖-明胶培养基：见附录A 中A.4。
3.5 含铁牛乳培养基：见附录A 中A.5。
3.6 0.1%蛋白胨水：见附录A 中A.6。
3.7 革兰氏染色液：见附录A 中A.7。
3.8 硝酸盐还原试剂：见附录A 中A.8。
3.9 缓冲甘油-氯化钠溶液：见附录A 中A.9。
4 检验程序
GB 4789.13—2012
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产气荚膜梭菌检验程序见图1。

5 操作步骤
5.1 样品制备
5.1.1 样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在2 ℃～5 ℃保存；如8 h 内不能进行检验，应以
无菌操作称取25 g（mL）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快至于-60 ℃
低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。
5.1.2 以无菌操作称取25 g（mL）样品放入含有225 mL 0.1%蛋白胨水（如为5.1.1 中冷冻保存样品，
室温解冻后，加入200 mL 0.1%蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1 min～2 min；或
置于盛有225 mL0.1%蛋白胨水的均质杯中，8 000 r/min～10 000 r/min 均质1min～2 min，作为1:10 稀释
液。
5.1.3 以上述1:10 稀释液按1 mL 加0.1%蛋白胨水9 mL 制备10-2～10-6 的系列稀释液。
检样
25g(mL)检样+225 mL0.1%蛋白胨水
均质、稀释
10-1～10-6 稀释液各1mL + TSC 琼脂混合
厌氧培养，36℃±1℃、20h～24h，黑色菌落计数
任选黑色菌落5 个，分别接种FTG 培养基
确证试验
镜检形态 牛奶发酵 动力-硝酸盐 乳糖-明胶
报告
GB 4789.13—2012
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5.2 培养
5.2.1 吸取各稀释液1 mL 加入无菌平皿内，每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50 ℃的TSC
琼脂（可放置于50 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）15 mL，缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。
5.2.2 上述琼脂平板凝固后，再加10 mL 冷却至50 ℃的TSC 琼脂（可放置于50 ℃±1 ℃恒温水浴箱
中保温）均匀覆盖平板表层。
5.2.3 待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，36 ℃±1 ℃培养20 h～24 h。
5.2.4 典型的产气荚膜梭菌在TSC 琼脂平板上为黑色菌落。
5.3 确证试验
5.3.1 从单个平板上任选5 个（小于5 个全选）黑色菌落，分别接种到FTG 培养基，36 ℃±1 ℃培养
18 h～24 h。
5.3.2 用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有
时可见芽孢体。如果培养液不纯，应划线接种TSC 琼脂平板进行分纯，36 ℃±1 ℃厌氧培养20 h～24 h，
挑取单个典型黑色菌落接种到FTG 培养基，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h，用于后续的确证试验。
5.3.3 取生长旺盛的FTG 培养液1 mL 接种于含铁牛乳培养基，在46 ℃±0.5 ℃水浴中培养2 h 后，每
小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上
升到培养基表面。5 h 内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发
酵”现象，但培养基不变黑。
5.3.4 用接种环（针）取FTG 培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，于36 ℃±1 ℃培养24 h。在透
射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌
株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5 mL 试剂甲和0.2 mL 试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15 min 内出现红
色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置10 min，出现红色者，
表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
5.3.5 用接种环（针）取FTG 培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，于36 ℃±1 ℃培养24 h，观察结果。
如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于5 ℃左右放置1 h，检查明胶液化情况。
如果培养基是固态，于36 ℃±1 ℃再培养24 h，重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使
明胶液化。
6 结果与报告
6.1 典型菌落计数
选取典型菌落数在20 CFU～200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。如果：
a) 只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU～200CFU 之间，计数该稀释度平板上的典型菌落；
b）低稀释度平板的典型菌落数均小于20 CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落；
c）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200 CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀
释度平板上的典型菌落；
d）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200 CFU，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的
典型菌落数不在20 CFU～200 CFU 之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；
e）2 个连续稀释度平板的典型菌落数均在20CFU～200CFU 之间，分别计数2 个稀释度平板上的典
型菌落。
6.2 结果计算
6.1 计数结果按公式（1）计算：
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式中：
T——样品中产气荚膜梭菌的菌落数；
A——单个平板上典型菌落数；
B——单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数；
C——单个平板上用于确证试验的菌落数；
n1 ——稀释度（低稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；
n2 ——第二稀释度（高稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；
0.1——稀释系数；
d——稀释因子（稀释度）。
6.3 报告
根据TSC 琼脂平板上产气荚膜梭菌的典型菌落数，按照6.2 中公式计算，报告每g（mL）样品中产
气荚膜梭菌数，报告单位以CFU/ g（mL）表示；如T 值为0，则以小于1 乘以低稀释倍数报告。

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附录A
培养基和试剂
A.1 胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂
A.1.1 基础成分
胰胨15.0 g
大豆胨5.0 g
酵母粉5.0 g
焦亚硫酸钠1.0 g
柠檬酸铁铵1.0 g
琼脂15.0 g
蒸馏水900.0 mL
pH 7.6±0.2
A.1.2 D-环丝氨酸溶液
溶解1 gD-环丝氨酸于200 mL 蒸馏水，膜过滤除菌后，于4 ℃冷藏保存备用。
A.1.3 制法
将基础成分加热煮沸至*溶解，调节pH，分装到500 mL 烧瓶中，每瓶250 mL，121 ℃高压灭菌
15 min，于50 ℃±1 ℃保温备用。临用前每250 mL 基础溶液中加入20 mL D-环丝氨酸溶液，混匀，倾注
平皿。
A.2 液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）
A.2.1 成分
胰蛋白胨15.0 g
L-胱氨酸0.5g
酵母粉5.0 g
葡萄糖5.0 g
氯化钠2.5g
硫乙醇酸钠0.5g
刃天青0.001g
琼脂0.75g
蒸馏水1 000.0 mL
pH 7.1±0.2
A.2.2 制法
将以上成分加热煮沸至*溶解，冷却后调节pH，分装试管，每管10 mL，121 ℃高压灭菌15 min。
临用前煮沸或流动蒸汽加热15 min，迅速冷却至接种温度。
A.3 缓冲动力-硝酸盐培养基
A.3.1 成分
蛋白胨5.0 g
牛肉粉3.0 g
硝酸钾5.0 g
磷酸氢二钠2.5g
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半乳糖5.0 g
甘油5.0 mL
琼脂3.0 g
蒸馏水1 000.0 mL
pH 7.3±0.2
A.3.2 制法
将以上成分加热煮沸至*溶解，调节pH，分装试管，每管10 mL，121 ℃高压灭菌15 min。如果
当天不用，置4 ℃左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热15 min，迅速冷却至接种温度。
A.4 乳糖-明胶培养基
A.4.1 成分
蛋白胨15.0 g
酵母粉10.0 g
乳糖10.0 g
酚红0.05g
明胶120.0 g
蒸馏水1 000.0 mL
pH 7.5±0.2
A.4.2制法
加热溶解蛋白胨、酵母粉和明胶于1000 mL 蒸馏水中，调节pH，加入乳糖和酚红。分装试管，每
管10 mL，121 ℃高压灭菌10 min。如果当天不用，置4 ℃左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热
15 min，迅速冷却至接种温度。
A.5 含铁牛乳培养基
A.5.1 成分
新鲜全脂牛奶1 000.0 mL
硫酸亚铁（FeSO4·7H2O） 1.0 g
蒸馏水50.0 mL
A.5.2 制法
将硫酸亚铁溶于蒸馏水中，不断搅拌，缓慢加入1000 mL 牛奶中，混匀。分装大试管，每管10 mL，
118 ℃高压灭菌12 min。本培养基必须新鲜配制。
A.6 0.1% 蛋白胨水
A.6.1 成分
蛋白胨1.0 g
蒸馏水1 000.0 mL
pH 7.0±0.2
A.6.2制法
加热溶解，调节pH，121 ℃高压灭菌15 min。
A.7 革兰氏染色液
A.7.1 结晶紫染色液
A.7.1.1 成分
结晶紫1.0g
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95%乙醇20.0 mL
1%草酸铵水溶液80.0 mL
A.7.1.2 制法
将结晶紫*溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
A.7.2 革兰氏碘液
A.7.2.1 成分
碘1.0 g
碘化钾2.0 g
蒸馏水300.0 mL
A.7.2.2 制法
将碘与碘化钾先混合，加入蒸馏水少许振摇，待*溶解后，再加入蒸馏水至300 mL。
A.7.3 沙黄复染液
A.7.3.1 成分
沙黄0.25 g
95%乙醇10.0 mL
蒸馏水90.0 mL
A.7.3.2 制法
将沙黄溶解于95%乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
A.7.4 染色方法
涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染色1 min，水洗。滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。滴
加95%乙醇脱色约15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。滴加沙黄复染液，复染1 min，
水洗、待干、镜检。
A.8 硝酸盐还原试剂
A.8.1 甲液（对氨基苯磺酸溶液）
在1 000 mL 5 mol/L 乙酸中溶解8 g 对氨基苯磺酸。
A.8.2 乙液（α-萘酚乙酸溶液）
在1 000 mL 5 mol/L 乙酸中溶解5 g α-萘酚。
A.9 缓冲甘油-氯化钠溶液
A.9.1 成分
甘油100.0 mL
氯化钠4.2 g
磷酸氢二钾（无水） 12.4 g
磷酸二氢钾（无水） 4.0 g
蒸馏水900.0 mL
pH7.2±0.1
A.9.2 制法
将以上成分加热至*溶解，调节pH，121 ℃高压灭菌15 min。配制双料缓冲甘油溶液时，用甘油
200 mL和蒸馏水800 mL。