饮用天然矿泉水中微生物监控技术及应用

本文根据广东环凯微生物科技有限公司仪器厂副厂长骆延平在“中国饮料工业协会天然矿泉水分会第十三次会员大会暨技术交流会”上分享的报告整理而成。

水，是生命之源。近几年来，在政府的高度重视和各生产厂家的共同努力下，包装饮用水（包括天然矿泉水）的产品质量得到了质的提升，但在市场抽检中不合格产品还是不时的被检出，主要涉及微生物、理化指标、污染物*、界限指标等方面，其中因为微生物因素被检出不合格的占70%以上。本文结合xin的食品安全国家标准GB 8537-2018和GB 19304-2018，分析饮用天然矿泉水微生物安全监控要点和技术，并分享xin的快速检测技术。

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饮用天然矿泉水

微生物安全的主要风险

根据有关部门统计，2014年至2018年，国家及省级食药监局共检出2350批次不合格的桶装水，其中，铜绿假单胞菌被检出高达1551次，占比60.8%，成为桶装水突出的质量安全问题。2017一2018年国省抽监督矿泉水抽检的情况（广东省），饮用天然矿泉水不合格率也达3.6%。这是由于桶装水企业中中小型企业较多，回收桶存在较多的微生物安全问题，所以桶装水生产企业抽检不合格率较高，从而导致的抽检不合格率较高。

国家标准规定，饮用天然矿泉水中不得添加任何防腐保鲜物质，使得其生产过程中的微生物污染控制要求更高；桶装矿泉水回收桶存在大量微生物，造成清洗消毒比较困难；矿泉水藻类污染相当普遍，这些都是矿泉水生产微生物安全的风险所在，而这些风险又存在于生产过程的所有环节。

微生物风险主要环节

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饮用天然矿泉水

微生物安全监控要点

从2019年6月21日起，矿泉水生产企业实施更严格的饮用天然矿泉水国家标准：GB 19304-2018 《食品安全国家标准 包装饮用水生产卫生规范》和GB 8537-2018《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水》 

● 新旧版标准在微生物要求方面的变化

在生产规范方面，增加了“包装饮用水加工过程的微生物监控程序指南”，为矿泉水生产企业生产过程微生物监控提供了更具体的指引，但也并未给出具体的参考*，需要企业根据实际情况进行制定。

在产品标准方面，修改了大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌和产气荚膜梭菌的*和采样方案，要求5份样品不得检出。

● 饮用天然矿泉水微生物安全监控要点

饮用天然矿泉水微生物安全监控是一个整体，贯穿于从水源到生产过程到包装的全流程。

1、水源的保护和微生物监控是基础

曾有调查显示，检测福建省77个生产厂家已投入灌装生产的80处饮用天然矿泉水水源，结果 80个检样中18件水样检出铜绿假单胞菌，阳性率22.50％，其检出率与水源的菌落总数和大肠菌群无显著相关性。广东省微生物研究所也曾对南方地区16家矿泉水生产企业的45份水源水进行检测。结果显示45份水源水中有11份样品检出铜绿假单胞菌,阳性率为24.44%。所以，自认为矿泉水水源深处地下，对水源的保护和微生物监控不予重视，寄希望于生产过程的后续杀菌，只会提高生产过程微生物消杀和监控的难度，增加成品微生物超标的风险。

2、 设备、管道、容器的微生物监控

采水设备、生产设备、管道、储水容器、包装容器等与产品直接接触的接触面在每次清洗消毒后都需要进行微生物监控，以确保不会对产品产生二次污染，接触面的微生物*可参照成品微生物*的指标，重点是要关注生物膜的形成对接触面微生物消杀和监控的影响。生物膜是一种附着于组织表面、由其自身产生的细胞外多聚基质包裹的有结构的菌细胞群体，由胞外基质及被黏连的菌细胞构成。根据我们的研究，铜绿假单胞菌容易形成生物膜，对外界不利环境有强烈的抵抗作用，对各种消毒剂不敏感，通透性差，因此形成生物被波的微生物不易被*清除。设备、管道、容器等不与产品接触的非接触面可根据所处环境洁净等级要求进行微生物的监控，设备和管道的非接触面的微生物监控可归类到生产环境微生物监控中。

3、 生产环境的微生物监控

生产环境的微生物监控包含空气（空间）微生物、人员表面微生物、设备和管道外表面微生物等的微生物监控。在xin国家标准GB 19304-2018中，只对灌装防护区有具体的洁净要求，具体的*我们可以参考GB 50687-2011 食品工业洁净用房建筑技术规范中表4.2.2。

4、 生产过程的微生物监控

生产过程中微生物监控按GB 19304-2018 食品安全国家标准 包装饮用水生产卫生规范中的附录A表A.1参照执行。

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饮用天然矿泉水

微生物监控技术

● 监控的频率

水源水：每年丰水期、枯水期各一次，特殊情况增加监测次数；

设备、管道、容器：每次清洗消毒后；

生产环境：每次消毒后；

过程水：每周、每两周或每月一次（根据实际情况）；

成品水：每批次。

● 微生物监控方法

1、水源水、过程水及成品水：依据GB 8538-2016 食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法，采用滤膜法进行检测。滤膜法微生物检测基本配置：1、不锈钢多联过滤系统；2、无菌滤膜；3、滤膜夹子；4、配套培养基；5、其它实验室常规微生物检测设备及耗材。

2、设备、人员、容器等表面微生物监控：可参考标准有：2015版中国药典；GB 15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准；GB 14934-2016 食品安全国家标准 消毒餐（饮）具；GB 15982-2012 医院消毒卫生标准；GB/T 18204.4-2013 公共场所卫生检验方法 第4部分：公共用品用具微生物。归纳起来检测的主要方法有：

2.1表面冲洗法：适用于监测大面积区域内表面的微生物含菌量，包括设备管道、储水罐、包装容器等。

2.2棉签擦拭法：适用于所有表面微生物采样，特别适用于不规则表面。

2.3接触平皿（接触碟）法：用于设备、车间、人员、包装材料等平整表面的微生物采样。可取代棉签擦拭法，减少采样步骤，确保取样的准确性和安全性，符合新版GMP标准所规定的采样要求，在药企被广泛使用。

3、空气微生物监控：空气微生物包括环境空气微生物和压缩空气（空气压缩机、高压气瓶等）的微生物。环境空气微生物的监控又分为沉降菌和浮游菌的的监控。

3.1 沉降菌：通过自然沉降原理收集在空气中的活微生物粒子，通过的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。根据xin标准GB 19304-2018 食品安全国家标准 包装饮用水生产卫生规范中附录规定，饮用天然矿泉水生产过程中沉降菌的测定标准是采用GB/T 18204.3-2013 公共场所卫生检验方法 第3部分：空气微生物，但饮用天然矿泉水的灌装防护区是洁净区，与公共场所的微生物含量差别较大，公共场所的沉降菌检测方法不适用于矿泉水生产的洁净区，建议采用GB/T 16294-2010 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法进行检测。

3.2 浮游菌：用浮游微生物采样器，收集悬游在空气中的生物性粒子，通过的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。浮游菌的检测方法可采用GB/T 16293-2010 医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法。

3.3 沉降菌和浮游菌的差异：1.沉降菌属于被动式采样，浮游菌属于主动式采样；2.沉降菌指飘落在地面或物体表面的灰尘中携带的微生物；浮游菌指在空气中漂浮的尘埃所携带的微生物；3.浮游菌浓度与沉降菌落数无线性关系,沉降菌的检测不能替代浮游菌的检测，要全面反映洁净区内微生物的污染程度,需同时检测沉降菌和浮游菌两项指标。

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一种水源性致病菌快速检测技术

环介导恒温扩增技术，简称LAMP技术，是目前分子检测手段中操作简单、灵敏度高、特异性很好的检测方法，具有广阔的应用前景。

检测原理：基于遗传性的DNA或RNA，针对靶基因的6个区域设计4条引物，双链DNA在65℃左右处于动态平衡状态；利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在靶序列两端引物结合处循环不断产生环状单链结构，使得引物在等温条件下引发新链合成，从而使靶基因扩增，扩增后的产物会引起指示剂颜色或荧光吸收值变化，从而判读结果。

产品应用：目前已有商业化的矿泉水中铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、粪性链球菌等检测的LAMP检测试剂盒。