生活饮用水标准之微生物的检测方法

检测依据：
      GB/T 5750.2-2006 生活饮用水标准检验方法 水样的采集和保存
      GB/T 5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法 微生物指标

本文主要包含
   1. 生活饮用水中的微生物指标
   2. 水样采集规则及注意事项
   3. 菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌的测定方法
   4. 对所检测水样的综合分析

生活饮用水中的微生物指标

菌落总数

水样在营养琼脂上有氧环境下，37℃培养48h后，所得1mL水样所含菌落的总数。

检测意义：作为一般性污染的指标，即评价被检样品的微生物污染程度和安全性。水样菌落总数越多，说明水被微生物污染程度越严重，病原微生物存在的可能性越大，但不能说明污染的来源。

总大肠菌群

指一群在37℃培养24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

检测意义：作为粪便污染的指标。水样总大肠菌群的含量，表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。

耐热大肠菌群

指一群在44-44.5℃培养24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。我国习惯上称之为“粪大肠菌群"。

微生物指标常规检验流程图

一、水样采集

采样原则：所采集的样品具有代表性。

采样容器：不能是新的污染源：不吸收或吸附某些待测组分不与待测组分发生反应。保证从采样到分析期间样品各组分的浓度不发生改变。

微生物样品必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证在运送、贮存过程中不受污染。

自来水水样：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌再开放水龙头使水流5min(经常用水的水龙头放水1~3min)后，采集水样于无菌玻璃瓶，约占瓶容量80%，以便摇匀水样。

水源水水样：选有代表性的地点及可疑地方，一般距水面下10-15cm采集，采样后在水中改好盖子，再从水中取出。

注意事项

1. 严格无菌操作。

2. 做好标记：采得水样后应立即记录水样名称、地点、时间等内容。

3. 从速送检。水样从采集到检验不应超过2h，在4℃下保存不应超过24h。

二、菌落总数测定

所需培养基和试剂：营养琼脂、9mL无菌生理盐水管。

自来水水样检测

操作步骤：

1. 以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入灭菌平皿中。

2. 倾注约15mL已融化井冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿；使水与培养基充分混匀（每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平只倾注营养琼脂养基作为空白对照）

3. 待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36℃±1℃培养箱内培养48h，进行菌落计数，即为水样1mL中的菌落总数。

4. 培养完成后，用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。

结果分析与报告：

计算平均菌落数，若菌落总数(CFU/mL)当检样的菌落数为1~100时，按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字报告。

国家标准(GB5749-2006)规定生活饮用水菌落总数每毫升不得超过100个。

水源水检测

操作步骤：

1. 以无操作方法吸取1mL充分混匀的水，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1:10稀释液。

2. 吸取1:10的稀释液1mL，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1:100稀师液，按同法依次稀释成1:1000，1:1000释液等备用（如此递增稀释一次，必须更换一支1m灭菌管）。

3. 然后用无菌极管取稀释的水样和2个~3个适释度的水样1mL，分别注入灭菌平皿内。之后操作同自来水水样的检验步骤。

结果分析与报告：计算平均菌落数，首先选择平均菌落在30~300之间者进行计算。

一般水源水中菌落总数与水清洁程度的关系：

注意事项

1. 菌落总数测定中，应选择合适的稀释度进行(生活饮用水，国家标准规定每毫升不得超过100个，因此以直接吸取1毫升到平板进行培养)

2. 各稀释管、相应半皿做好标记。包括：水样名称、稀释度、时间、小组。

3. 严格无菌操作进行水样稀释时，每一稀释度均需更换吸管。

4. 倾注时，要注意营养琼脂的温度。

5. 倾入琼脂后要混匀，待琼脂凝固后倒置培养。

三、总大肠菌群测定

所需培养基和试剂：乳糖蛋白胨培养液、双料乳糖蛋白胨培养液、伊红美蓝培养基。

多管发酵法步骤：

初步发酵试验：采用乳糖蛋白培养液36℃±1℃培养24h观察产酸产气情况。

平板分离：对阳性管培养物，接种于伊红美蓝培养基观察菌落特征，并进行革兰氏染色和镜检。

复发酵证实试验：对典型和可疑菌落，接种于乳糖蛋白胨培养液，进行复发酵证实试验。

结果报告(MPN)：根据 GB 5750.12-2006 所附检索表报告结果。

四、耐热大肠菌群测定

所需培养基和试剂：乳糖蛋白胨培养液、EC肉汤、伊红美蓝培养基

多管发酵法步骤：

初步发酵试验：采用乳糖蛋白培养液36℃±1℃培养24h观察产酸产气情况。

耐热培养：阳性管接种在EC肉汤管中，44.5℃培养24h观察产酸产气情况。

平板培养：阳性管接种在EMB平板上，36℃±1℃培养24h。

结果报告(MPN)：根据 GB 5750.12-2006 所附检索表报告结果。

五、大肠埃希氏菌测定

所需培养基和试剂：EC-MUG培养基

多管发酵法步骤：

耐热培养：将总大肠菌群初发酵中产酸或产气的管进行大肠埃希氏菌检测，接种此类试管中的液体到EC-MUG管中，在培养箱或恒温水浴中44.5℃培养24h。如使用恒温水浴，在接种后30min内进行培养，使水浴液面超过EC-MUG管的液面。

结果报告(MPN)：
   将培养后的EC-MUG管在暗处用366nm紫外灯照射，如有蓝色荧光，则表明水样中含有大肠埃希氏菌。
   计算EC-MUG阳性管数，根据GB 5750.12-2006所附检索表报告结果。