真菌菌种保存全攻略：方法、步骤与注意事项

真菌是一类多样性丰富的微生物，随着保存时间的延长和不断的传代需要，真菌的毒力、致病性、生长速度等基本特性会发生改变。为了最大限度保持真菌的活性、形态学、生理学、遗传完整性等特性，往往需要几种培养和保存方法。理想情况下，保存的菌种在长期保存下仍具有活性，但处于静止状态，以防突变的积累导致形本学和生化特性的改变。常用的菌种保存方法有持续传代，保存于无菌水、土壤或矿物油中，冷冻或真空干燥等。

持续传代法是将真菌持续地在琼脂上接种生长，是一种短期的保存方法。将培养物存放于4~25℃ 或将其冷冻可以增加传代的间隔。将真菌保存于无菌水放置在室温是一种简易经济的方法，但真菌细胞的稳定性无法得到保障。利用冷冻法，如液氮或低温(一20℃和-80℃)可以较好地弥补水保存法的不足。国际上的一些真菌研究机构推荐使用冷冻法和冻干法进行菌种保存。尽管对活细胞进行冻干可以长期保证细胞的稳定性，但整个程序冗长耗时，且需要昂贵的设备。因此冷冻法的使用最为广泛，大多数真菌可使用此法进行保存。

一、水保存法

1）操作步骤
1、将真菌接种在带螺口盖的玻璃管PDA斜面培养基，置于25℃培养2周，向培养管内加入6~7ml 的无菌蒸馏水。 
2、使用移液器枪头在斜面上轻轻刮取孢子或菌丝片段，收集上清悬液并转移至无菌的带螺口瓶内。 
3、将瓶盖旋紧，以防止水分的蒸发，如发生蒸发可定期添加无菌蒸馏水，在瓶上做好标记储存于室温。 

2）活性检测：无菌条件下从瓶内吸取0.3ml悬液接种至SDA或PDA斜面，于25℃培养3周，定期观察生长情况3周后如无生长，或重复转种培养后仍无生长，表明保种物无活性。

二、冷冻保存法

1）操作步骤：
1、将真菌接种在带螺口盖的聚丙烯管PDA斜面培养基，置于25℃培养2周。 
2、旋紧瓶盖，置于冷冻冰箱(-20℃以下) 。

2）活性检测：从冰箱取出培养管，自冰冻的PDA斜面挖取一小部分菌落接种至另一PDA斜面培养基，于25 ℃培养至少3周。如复苏生长的菌落特点与保种之前的特性一致，表明保种切实可行；如转种的菌落无生长或菌落的特性与初始特性不一致，按上述方法重复转种。如第二次转种仍无生长表明保种失败。 
注意：培养管自冰箱取出后应尽快操作，避免融化，尽快放回冰箱，否则影响真菌的存活率。 

三、矿物油浸没法

1）操作步骤：
1、准备高等级的矿物油，121℃高压15min。 
2、将真菌接种在带螺口盖的玻璃管PDA斜面培养基，置于25℃培养2周。
3、向培养管内加入矿物油，以矿物油高出斜面1cm为宜，确保培养管的斜面和所有菌落完quan被浸没。
4、将培养管直立放置于室温，定期观察矿物油水平及含量，必要时适量添加。 

2）活性检测：从保种培养斜面挑取小量菌落接种至适当的培养基(PDA或SDA),取菌时尽量沥去矿物油。由于菌落黏附矿物油，菌落的生长速度会较慢，可能需要传代多次。理想的操作方法可以将菌落接种在斜面培养基的中点，可以使多余的矿物油流至管底。 

四、冷冻干燥法

冷冻干燥保存适合产孢的真菌，特别是一些能够产生子囊孢子和分生孢子的真菌，保存周期长，可达20~40年。 

1）操作步骤：
1、将真菌接种在带螺口盖的玻璃管PDA斜面培养基，置于25℃培养至生长良好。
2、刮取适量真菌与保护剂(如脱脂牛奶)混匀后，加入安瓿瓶中，在一40℃冰箱预冷2h。 
3、置于冷冻干燥机上冷冻干燥8~20h，熔封。 
4、测定真空度，合格后2-8℃保存。

2）活性检测：配制液体SGA或者MEA培养基，安瓿瓶打开后将粉末倒入以上培养基，适宜条件下生长1~3周， 保存良好的菌落可以恢复生长。